转化
实验目的
掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定原理和实验方法。
实验原理
大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
仪器和材料
超净工作台、恒温培养箱、移液枪、冷冻循环水浴锅、恒温摇床、感受态细胞DH5α、Amp+ LB液体培养基、Amp- LB液体培养基、Amp+ LB固体培养基、X-gal (20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)。
实验步骤
- 将连接产物10μl加入到已制备好的感受态细胞中，冰上孵育30min。
- 42℃水浴中热休克90s，立即冰上冷却2min。
- 加入200μl不含氨苄(AMP)的LB液体培养基，37℃，150rpm，振荡培养40min。
- 加40μl的X-Gal (20mg/ml)和8μl IPTG(200mg/ml)。
- 约200μl转化产物涂布于培养平板上。放置于37℃培养箱，待溶液被琼脂吸干，倒置平板，37℃，培养16h。
- 第二天上午观察蓝白斑筛选结果。
思考
- 在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入氨苄青霉素？
- 蓝白斑筛选的原理？