菌液PCR验证
实验目的
掌握PCR扩增筛选重组子的方法
实验原理
PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
由于重组子中包含外源片段，利用根据外源片段设计的引物，以菌液为模板，进行PCR扩增，就能扩增出外源片段。反之，如果菌液中没有重组子，则扩增不出外源片段。由此，可以利用PCR扩增的方法鉴定阳性重组子。
实验材料与仪器
PCR仪、Taq DNA polymerase、 dNTP、18s-rRNA上游引物、18s-rRNA下游引物、无菌水
实验步骤：
- 按如下成分于冰上配制反应混合液：
| 成分 | 体积(μl) |
|---|---|
| 菌液 | 1.0 |
| 无菌水 | 13.8 |
| 10XPCR buffer | 2.0 |
| MgCl | 1.2 |
| dNTP | 0.4 |
| 18s-rRNA上游引物 | 0.8 |
| 18s-rRNA下游引物 | 0.8 |
| Total | 20.0 |
- 混匀，短暂离心，放入PCR仪。
- 运行以下程序：95℃预变性5min，然后95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
- PCR结束后，分别取5μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。拍照。
注意事项：
- 吸取每一种试剂，必须用新的枪头，防止样品间污染。
- 菌液预先热变性。