RNA 的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调节和 cDNA 的合成都是必须的， RNA 的纯度和完整性对于 Northern blot， RT-PCR 和 cDNA 文库的构建等分子生物学实验都至关重要。 RNA 分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少 RNA 酶的污染。
所有的组织中均存在RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

实验目的：

掌握提取RNA的原理和方法

实验原理：

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

实验材料与仪器：

金鱼、低温高速离心机、移液枪、DEPC处理的枪头和离心管、5ml一次性注射器、RNAiso Plus、氯仿、异丙醇、75%酒精、无水乙醇、DEPC-treated water、TAE缓冲液

实验步骤：

组织匀浆：将金鱼冰上麻醉，迅速取50mg肝脏组织，加入1mL RNAiso Plus，在冰上用1mL一次性注射器反复抽打，直到组织没有明显颗粒。室温放置5min，令细胞充分裂解。
加入200μL氯仿，轻微震动15s，室温静置2-3min，以便使溶液分层。4℃，12,000×g，离心15min。
小心吸取400μL上清液至另一新的1.5ml的离心管中，加入异丙醇500μL，上下翻转，室温静置10min。4℃，12,000×g，离心10min。
小心弃去上清, 切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入1mL75%乙醇洗涤RNA沉淀，涡旋振荡后4℃，7,500×g离心5min。
弃上清，用枪头小心除去剩余乙醇，空干RNA沉淀。
最后加入适量DEPC处理的水充分溶解RNA。必要时可55℃-60℃水溶 10 分钟。
紫外分光光度计测RNA浓度。
将约2μL总RNA上样于0.8%琼脂糖凝胶，检测RNA完整度。

结果分析：

根据所测的OD值计算所提取的RNA浓度。
电泳图片，并对电泳结果进行分析。

思考题：

分别说出氯仿、异丙醇和酒精在RNA提取过程中的作用。

注意事项：

● RNA 提取实验前的准备

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
（1）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。
（2）然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。
PS：RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。
使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。如果使用的试剂不能高温高压灭菌，请使用高压灭菌后的仪器盛装，无菌过滤后使用。
请使用一次性塑料手套和口罩进行所有试剂配制和实验操作，以避免 RNase 污染。

● RNA 纯度分析

用琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖+溴乙锭）分析
电泳用于分析按以上方法提取获得的 1-2 μg 热变性 total RNA。对于没有降解的 RNA 可能是 2 种核糖体 RNA（真核细胞：28S 和 18S），条带亮度约为 2:1。但如果核糖体 RNA 条带弥散，说明可能 RNA 已降解。此外，如果条带大小超过 28S，可能存在基因组 DNA 污染，建议使用 DNase I 处理。
吸光度分析
用 TE Buffer 稀释 RNA 后测定吸光度，OD260/OD280 比值在 1.7-2.1 为好。
例：
RNA 浓度计算方法：
RNA 浓度（μg/μl）=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04

动物

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