RT-PCR
实验目的
掌握逆转录反应的实验原理和步骤和PCR扩增方法；了解RT-PCR的原理，掌握RT-PCR扩增基因的特异片段的技术。
实验原理
编码蛋白质的基因在转录后形成mRNA，mRNA 翻译后编码产生蛋白质。真核生物的mRNA 的3端有多个腺苷酸，形成寡聚腺苷酸的尾巴，因此可以与Oligo dT结合，在反转录酶的作用下合成互补链，即cDNA。cDNA可以作为模板，根据基因特异性引物，进行PCR扩增，检测基因表达量。
PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
定量PCR是要检测某个基因的表达，降低或者提高，但是当你得出结果以后，你并不知道是它本身的表达降低/提高了，还是你操作过程中造成的误差（比如提RNA时的损失），所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照。这个基因就是内参基因，这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。常用的内参基因如 β-actin，GAPDH，18s-rRNA等。
实验材料与仪器
Total RNA、反转录试剂盒、移液枪、PCR仪、离心机、制冰机、PCR仪、Taq DNA polymerase、dNTP、18s-rRNA上游引物、18s-rRNA下游引物、无菌水
实验步骤
1) 先从超低温冰箱取出之前提取的RNA样品，冰上解冻。
2) 反转录反应
（1）按下列组份配制RT反应液（配制请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大体积配制反液最后加入RNA样。
| 成分 | 体积(μl) |
|---|---|
| 5×PrimeScript Buffer | 2.0 |
| PrimeScriptRT Enzyme Mix I | 0.5 |
| Oligo dT Primer（50μM） | 0.5 |
| Random 6 mers | 0.5 |
| RNA | X |
| RNase Free dH2O | up to 10 |
（2）混匀，短暂离心，放于PCR仪里。
（3）反转录反应条件如下:
37℃ 15 min（反转录反应）
85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）
4℃
3) PCR扩增
（1）按如下成分于冰上配制反应混合液：
| 成分 | 体积(μl) |
|---|---|
| cDNA模板 | 1.0 |
| 无菌水 | 12.6 |
| 10XPCR buffer | 2.0 |
| MgCl | 1.2 |
| dNTP | 0.4 |
| 18s-rRNA上游引物 | 0.8 |
| 18s-rRNA下游引物 | 0.8 |
| Taq DNA polymerase | 0.4 |
| Total | 20.0 |
（2）混匀，短暂离心。放入PCR仪。
（3）运行以下程序：95℃预变性5min，然后95℃预变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
（4）PCR结束后，分别取5μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，拍照。
注意事项：
- 逆转录时全程戴手套操作。
- 吸取每一种试剂，必须用新的枪头，防止样品间污染。
- 由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时要使用精确、量程适合的移液枪，并且不要使Tip插入液面过深，否则会因Tip壁粘着造成损失，而使酶量不足。
思考题：
提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，我们应该采取什么措施？